Per procedere all'identificazione di un batterio, si usano le seguenti metodologie:
riconoscimento a
microscopio
ottico o elettronico
colorazione di Gram
, analisi della morfologia della
colonia
, mobilità, capacità di produrre
spore
, acido-resistenza e esigenza di condizioni aerobiche o anaerobiche per la crescita
La colorazione di Gram è una delle metodologie più utilizzate e si basa sulla distinzione delle caratteristiche della
parete batterica
: una struttura con più
peptidoglicani
si colora e di conseguenza si dice che il batterio è
Gram-positivo
; una minor presenza di peptidoglicani contraddistingue i
Batteri Gram-negativi
Altre prove di natura
biochimica
, quali:
la valutazione della capacità del microrganismo di metabolizzare particolari
terreni
(con conseguente generazione di acidi e/o gas);
di produrre particolari
enzimi
(es.
catalasi
fosfatasi
), oppure di ridurre od ossidare determinati componenti.
I batteri si possono trovare, sotto forma di spore, in forma di vita latente, molto resistente a condizioni estreme. I batteri sporigeni sono specie che, trovandosi in scarsità di nutrimento o in un
habitat
a loro ostile, producono delle
spore
, ossia delle cellule resistenti agli agenti esterni. I batteri sporigeni sono il più delle volte dei
bacilli
Gram-positivi e
clostridi
Le più moderne tendenze sono inoltre volte all'osservazione di caratteristiche
genetiche
anziché morfologiche o biochimiche.
Tra le più diffuse tecniche DNA-based impiegate, vi sono:
VNTR
Variable Number of Tandem Repeat
);
PFGE
Pulsed-Field Gel Elettrophoresis
);
MLST
Multi-Locus Sequence Typing
);
sequenziamento dell'intero genoma batterico per individuare in modo inequivocabile la specie del batterio osservato.
I batteri posseggono una
parete batterica
, composta da peptidoglicani, una parte proteine e una parte peptina, che è una struttura caratteristica della cellula procariotica, e al di sotto della parete è presente la
membrana cellulare
: su di essa si trovano quasi tutti gli enzimi che svolgono le
reazioni metaboliche
. Il
DNA
non è sempre presente sotto forma di cromosoma singolo e circolare: esso può essere circolare o lineare e possono essere presenti fino a tre cromosomi in una stessa cellula batterica. Il DNA si trova in una zona chiamata
nucleoide
e non è separato dal
citoplasma
da alcuna
membrana nucleare
, che invece è presente nelle cellule eucariotiche; nel citoplasma si trovano anche piccole molecole circolari di DNA chiamate
plasmidi
. Posseggono organi di locomozione:
fimbrie
o uno o più
flagelli
La parete batterica può essere rivestita esternamente da una
capsula
, formata di regola da
polisaccaridi
secreti dai batteri stessi. Nel caso di
Bacillus anthracis
, la capsula è composta da
polipeptidi
dell'
acido D-glutammico
. La presenza di capsula conferisce alle colonie batteriche un aspetto "liscio" o "mucoide", mentre quelle prive di capsula manifestano un aspetto "rugoso".
La funzione della capsula è quella di proteggere meccanicamente la cellula procariotica dall'ambiente esterno.
Batteri visti al microscopio (1000X)
La
membrana cellulare
ha una
struttura a mosaico fluido
come quella degli eucarioti, tuttavia non è dotata di
steroli
. Fanno eccezione i
micoplasmi
, che incorporano gli steroli nella membrana quando si sviluppano in terreni che li contengono. Nei Gram-negativi può essere anche chiamata
membrana interna
, in contrapposizione alla loro
membrana esterna
Le principali funzioni della membrana sono:
barriera semipermeabile
, piattaforma di supporto per enzimi della
catena respiratoria
e delle biosintesi di
fosfolipidi
di membrana, di
polimeri
della parete e del
DNA
Le membrane cellulari batteriche formano centri di proteine fosforiche dette introflessioni o
mesosomi
, di cui si distinguono due tipi: mesosomi settali, che intervengono nella formazione del setto durante la
divisione cellulare
, e mesosomi laterali, che costituiscono una piattaforma sulla quale si associano
proteine
cellulari, quali gli enzimi della catena respiratoria (svolgendo una funzione analoga all'energia liberata dall'idrolisi di
adenosintrifosfato
(ATP) per trasportare
zuccheri
amminoacidi
vitamine
e piccoli peptidi. Le proteine di trasporto sono dette transporters o permeasi e sono responsabili della
diffusione facilitata
[tipo canale o tipo
carrier
(uniporto)], del
trasporto attivo primario
, del
trasporto attivo secondario
(tipo simporto o antiporto) e del trasporto con
fosforilazione
del substrato (fosfotransferasi).
Circa la metà delle proteine di trasporto dei batteri appartengono al sistema di trasporto attivo primario ABC (ATPase Binding Cassette) e al sistema di diffusione facilitata/trasporto attivo secondario MFS (major facilitator superfamily).
Le permeasi batteriche sono generalmente inducibili, per cui la densità delle proteine di trasporto nella membrana è regolata dalla concentrazione del soluto nel mezzo e dalle necessità metaboliche della cellula.
Il trasporto dal citoplasma allo spazio extracitoplasmatico comprende due sistemi di efflusso noti, entrambi presenti nella membrana citoplasmatica: sistema antiporto H+/farmaci e proteine della famiglia
ABC
Le ABC permeasi trasportano sia piccole molecole sia macromolecole in risposta alla
idrolisi
di
ATP
. Questo sistema di trasporto è composto da due proteine integrali di membrana con sei segmenti transmembranosi, due proteine periferiche associate sul versante citoplasmatico, che legano idrolizzano l'ATP, e una proteina o
lipoproteina
recettoriale
periplasmica (vedi sotto) che lega il substrato.
Le ABC permeasi più studiate comprendono il sistema di trasporto del
maltosio
di
Escherichia coli
e quello dell'
istidina
di
Salmonella typhimurium
Dal momento che i batteri Gram-positivi sono privi della membrana esterna, il recettore, una volta secreto, si perderebbe nell'ambiente extracellulare. Di conseguenza, questi recettori risultano legati alla superficie esterna della membrana citoplasmatica mediante ancore lipidiche.
Poiché di frequente i batteri vivono in mezzi dove la concentrazione di nutrienti è bassa, le proteine ABC permettono alla cellula di concentrare i nutrienti nel citoplasma contro il
gradiente di concentrazione
La superfamiglia MFS (detta anche famiglia uniporto-simporto-antiporto) comprende proteine di trasporto composte da una sola catena polipeptidica che possiede 12 o 14 potenziali segmenti transmembranosi ad
alfa elica
. È interessata alla diffusione facilitata e al trasporto attivo secondario (simporto o antiporto) di piccoli soluti in risposta a gradienti ionici chemiostitici (principalmente gradienti di H+ o Na+): zuccheri semplici, oligosaccaridi, inositoli, amminoacidi,
nucleosidi
, esteri organici del fosfato, metaboliti del ciclo di Krebs, farmaci e una gran varietà di
anioni
cationi
organici.
La
parete cellulare
presenta una struttura notevolmente diversa a seconda che si tratti di batteri Gram-positivi o Gram-negativi, anche se il
peptidoglicano
costituisce la sostanza universalmente presente nella parete cellulare dei batteri. Nei batteri Gram-negativi lo strato di peptidoglicano è piuttosto sottile, con uno spessore di circa 50-100
Ångström
. La maggioranza dei batteri Gram-positivi ha invece una parete cellulare relativamente spessa (circa 200-800 Ångström), in cui al peptidoglicano sono covalentemente legati altri polimeri, quali
acidi teicoici
, polisaccaridi e peptidoglicolipidi. Esternamente al peptidoglicano i batteri Gram-negativi hanno una membrana esterna di spessore di circa 75-100 Ångström.
Il
peptidoglicano
, detto anche
mucopeptide batterico
mureina
, è composto da un peptide complesso formato da un
polimero
di
aminoglucidi
peptidi
. Nei
batteri Gram-positivi
è disposto in molteplici strati, tanto da rappresentare dal 50% al 90% del materiale della parete cellulare, mentre nei
batteri Gram-negativi
vi sono uno o al massimo due strati di peptidoglicano, che costituiscono il 5%-20% della parete.
Il peptidoglicano è un polimero composto da: una catena principale, identica in tutte le specie batteriche, formata da subunità disaccaridiche di
-acetilglucosamina
e da
acido
-acetilmuramico
, unite da legame Beta, 1-4 glicosidico; catene laterali di un identico
tetrapeptide
, legato all'acido
-acetilmuramico; di solito, una serie di ponti peptidici trasversali, che uniscono i tetrapeptidi di polimeri adiacenti. I tetrapeptidi dei polimeri adiacenti possono essere legati, invece che da ponti peptidici, da legami diretti tra la D-alanina di un tetrapeptide e la L-lisina o l'acido diaminopimelico del tetrapeptide adiacente. Le catene tetrapeptidiche laterali e i ponti trasversali variano a seconda della specie batterica.
Il peptidoglicano dei batteri Gram-positivi è legato a molecole accessorie, come acidi teicoici, acidi teucuronici, polifosfati o carboidrati. La maggior parte dei batteri Gram-positivi contiene considerevoli quantità di
acidi teicoici
, fino al 50% del peso umido della parete. Si tratta di polimeri idrosolubili, formati da
ribitolo
glicerolo
, uniti da
legami fosfodiesterici
. Il ribitolo e il glicerolo possono legare residui glucidici, come
glucosio
galattosio
-acetilglucosamina, e di solito
D-alanina
, in genere legata in posizione 2 o 3 del glicerolo oppure 3 o 4 del ribitolo.
Gli acidi teicoici rappresentano i principali
antigeni
di superficie dei batteri Gram-positivi che li contengono.
La parete dei batteri gram-negativi è notevolmente più complessa, in quanto esternamente allo strato di peptidoglicano è presente la membrana esterna; le due strutture sono legate dalla lipoproteina.
La componente proteica della
lipoproteina
è unita con
legame peptidico
ai residui di DAPA (acido diaminopimelico) delle catene laterali tetrapeptidiche del peptidoglicano, mentre la componente lipidica è fissata con
legame covalente
alla membrana esterna, del cui foglietto interno è una componente importante.
La membrana esterna ha la struttura tipica delle membrane biologiche ed è riscontrata solo nei batteri Gram-negativi, esternamente alla loro parete cellulare. Gran parte del foglietto fosfolipidico esterno è composto da molecole di
lipopolisaccaride
(LPS), o
endotossina
dei batteri gram-negativi, formato da un
lipide
complesso, chiamato lipide A, a cui è unito un
polisaccaride
composto da una parte centrale e da una serie terminale di unità ripetute.
Il lipide A è formato da una catena di disaccaridi della
glucosammina
, uniti da ponti di
pirofosfato
, a cui sono legati numerosi
acidi grassi a catena lunga
, fra cui l'
acido beta-idrossimiristico
(C14), sempre presente è caratteristico di questo lipide.
La parte centrale del polisaccaride è costante in tutte le specie batteriche gram-negative, mentre le unità ripetute sono specie-specifiche e sono costituite di solito da trisaccaridi lineari oppure da tetrasaccaridi o pentasaccaridi ramificati.
Il polisaccaride costituisce l'antigene O di superficie e la specificità antigenica è dovuta alle unità ripetute terminali. La
tossicità
del LPS è invece dovuta al lipide A.
Fra le principali proteine della membrana esterna, le più abbondanti sono le
porine
Le porine sono proteine transmembranose, organizzate in triplette, ciascuna subunità è formata da 16 domini in
conformazione beta
disposizione antiparallela
che danno origine a una struttura cilindrica cava. Il canale consente la
diffusione
di
molecole idrofile
di
p.m.
< 600-700
Da
(fosfati, disaccaridi, ecc.), mentre le
molecole idrofobe
(compresi alcuni antibiotici beta-lattamici, come
ampicillina
e cefalosporine) possono attraversare la componente lipidica della membrana esterna.
Altre proteine della membrana esterna permettono la diffusione facilitata di numerose sostanze, quali
maltosio
vitamina B12
nucleosidi
e complessi ferro-carboniosi, mentre non sembra siano presenti sistemi di trasporto attivo.
Oltre alle proteine di trasporto, sono presenti recettori per la
coniugazione batterica
, per i
fagi
e le colicine (il recettore per il fago T6 e la colicina k è anche implicato nel trasporto dei
nucleosidi
).
Tra la membrana interna e quella esterna è compreso lo spazio periplasmico, parzialmente occupato dal peptidoglicano con la sua porosità. In questo spazio sono presenti le proteine periplasmiche: binding-proteins, che specificamente legano zuccheri, aminoacidi e ioni, coinvolte nell'attività recettoriale e di trasporto; enzimi, come le
betalattamasi
, codificate dai plasmidi. Lo spazio periplasmico è più spesso nei gram-negativi e più sottile nei Gram-positivi.
Nei batteri non fotosintetici, l'
ATP
viene prodotto da reazioni di
ossidoriduzione
Vi sono due meccanismi generali per la formazione di ATP negli organismi non fotosintetici: la
respirazione
, in cui il substrato organico o inorganico è ossidato completamente (nel caso di composti del carbonio, es. glucosio, l'ossidazione completa produce CO
e H
O) e gli elettroni sono trasportati attraverso una catena di trasporto di elettroni (
catena respiratoria
) fino all'accettore finale, che è
ossigeno
, nella
respirazione aerobia
, o un substrato diverso (NO
, SO
, CO
, fumarato), in caso di
respirazione anaerobica
; la
fermentazione
, in cui il substrato organico è ossidato parzialmente e l'accettore finale di elettroni è un composto organico, senza che vi sia l'intervento di una catena di trasporto di elettroni. I processi di fermentazione prendono il nome dal prodotto finale (
f. lattica
alcolica
butirrica
propionica
, ecc.).
Nella catena respiratoria, i portatori di elettroni sono ancorati nella membrana cellulare, in modo tale che il passaggio di elettroni sia seguito dal trasferimento di
protoni
(H
) dal citoplasma all'esterno. Poiché la membrana è impermeabile ai protoni, questo fenomeno determina un gradiente di protoni. L'energia del gradiente di protoni può essere utilizzata in diversi processi, quali la generazione di ATP (
modello chemiosmotico
di formazione dell'ATP) o il trasporto di soluti. L'ATP si forma quando gli H
diffondono nella cellula attraverso le
ATP sintasi
, il passaggio dei protoni attraverso queste proteine determina la conversione enzimatica di
ADP
fosfato inorganico
in ATP.
E. coli
è uno dei batteri più studiati. Gli studi hanno dimostrato che
E. coli
può utilizzare diversi enzimi nella catena respiratoria, a seconda delle condizioni ambientali, in particolare della presenza o meno di ossigeno, e del tipo di substrato presente in caso di condizioni anaerobie.
In
condizioni aerobie
E. coli
sintetizza due distinte
citocromo-ossidasi
(citocromossidasi o e d), mentre in
condizioni anaerobie
può utilizzare nella catena respiratoria almeno cinque
ossidoriduttasi
terminali, che impiegano come accettori terminali di elettroni
nitrato
dimetilsolfossido
(DMSO), trimetilamina-
-ossido (TMAO), o
fumarato
Nella catena respiratoria, un pool di
chinoni
ubichinone
o menachinone) accoppia l'
ossidazione
di
NADH
per opera della
NADH-deidrogenasi
alla
riduzione
dell'accettore terminale di elettroni da parte delle
ossidoreduttasi
terminali.
La
citocromossidasi
o è l'enzima prevalente in condizioni ricche di ossigeno, ma con il diminuire della concentrazione di O
i livelli della citocromossidasi o si riducono, mentre quelli della citocromossiadasi d aumentano. In condizioni povere di ossigeno, la sintesi degli enzimi della respirazione anaerobia permette di utilizzare accettori di elettroni diversi da O
, consentendo alla cellula procariota di mantenere il più efficiente
metabolismo respiratorio
in luogo del
metabolismo fermentativo
La sintesi delle ossidoreduttasi anaerobie è nitrato-dipendente, nel senso che il
nitrato
è l'
accettore di elettroni
preferenziale, per cui quando, in condizioni anaerobiotiche, la sua concentrazione è elevata, la sintesi della
nitrato reduttasi
è elevata mentre quella degli altri enzimi (DMSO/TMAO-reduttasi e fumarato-reduttasi) rimane bassa. Soltanto quando il nitrato è deficitario, la sintesi delle altre ossidoreduttasi aumenta.
Questo tipo di regolazione degli enzimi della catena respiratoria permette di utilizzare al meglio lo spazio disponibile sulla membrana cellulare.
In assenza dei substrati alternativi delle ossidoreduttasi, la cellula utilizza la fermentazione.
In presenza di nitrato e in condizioni di anaerobiosi, la nitrato-reduttasi respiratoria (Nar) costituisce circa il 50% delle proteine della membrana cellulare di
E. coli
, mentre la formato-deidrogenasi ne rappresenta il 10% circa. Quindi, sebbene diversi donatori possano fornire elettroni alla Nar (es., NADH-deidrogenasi,
succinato-deidrogenasi
lattato deidrogenasi
) il sistema
formato
-nitrato reduttasi riveste una grande importanza fisiologica nelle suddette condizioni ambientali.
Nar è composta da tre subunità proteiche: subunità catalitica NarG, che riduce il nitrato; subunità NarH, che contiene un centro [3Fe-4S] e tre centri [4Fe-4S] e trasferisce gli elettroni tra le altre due subunità; subunità NarI, che grazie ai suoi cinque domini transmembranosi ancora le altre due subunità alla membrana, inoltre contiene un citocromo b e ossida i chinoni (ubichinone o menachinone), liberando due protoni nello spazio periplasmico. Gli elettroni sono trasferiti dai chinoni a NarI, quindi attraverso i centri Fe-S di NarH a NarG.
In
E. coli
sono presenti due
isoenzimi
Nar: NarA e NarZ. Il primo isoenzima è inducibile ed è espresso in condizioni di anaerobiosi e in presenza di nitrato; si ritiene che sia responsabile del 90% dell'attività nitrato-reduttasica. Il secondo isoenzima è presente costitutivamente e mostra una modesta induzione da parte del nitrato. Il ruolo fisiologico della NarZ è quello di assicurare un rapido adattamento agli improvvisi passaggi dall'aerobiosi alla anaerobiosi, in attesa che la sintesi di NarA raggiunga livelli sufficienti.
La Nar dei batteri intestinali è responsabile della
nitrosazione
delle
ammine
alchiliche e aromatiche a causa della sua debole capacità di generare
NO
. La formazione dei nitroso-composti è una delle possibili cause del
cancro gastrico
La sintesi della
parete cellulare
nei
batteri Gram-positivi
si sviluppa in 3 stadi, che si svolgono in distinti compartimenti cellulari:
citoplasma
membrana cellulare
e parete cellulare.
La sintesi dei
precursori
della parete cellulare comincia nel citoplasma e porta alla formazione dell'UDP-NAM-pentapeptide nucleotide di Park (UDP-MurNAc-L-Ala-D-iGlu-L-Lys-D-Ala-D-Ala). Inizialmente si verifica l'attacco dell'
acetil-glucosamina
all'
UDP
e quindi la conversione ad acido UDP-muramico per
condensazione
con
fosfoenolpiruvato
riduzione
. Gli
aminoacidi
del pentapeptide vengono aggiunti singolarmente, con l'intervento di uno specifico
enzima
per ciascun amminoacido.
Il nucleotide di Parker è trasferito su un
lipide
della membrana cellulare, in seguito al
Legame fosfo-estereo
con un undecaprenil-pirofosfato a spese dell'UDP, così da formare il lipide I (C55-PP-MurNAc-L-Ala-D-isoGlu-L-Lys-D-Ala-D-Ala). Dopo un'ulteriore modificazione che comporta l'aggiunta di un
disaccaride
per interazione con UDP-GlcNAc, così da generare il lipide II [C55-PP-MurNAc(-L-Ala-D-isoGlu-L-Lys(Gly5)-D-Ala-D-Ala)- 1-4-GlcNAc], il precursore del peptidoglicano, ancorato al lipide, è traslocato alla superficie extracitoplasmatica della membrana cellulare.
Quindi il precursore del peptidoglicano è incorporato nella parete cellulare, attraverso reazioni di transpeptidazione e transglicosilazione, con il contemporaneo distacco dal carrier lipidico. L'assemblaggio della parete cellulare è catalizzato dagli enzimi PBP (proteine che legano la
penicillina
), localizzati nella membrana citoplasmatica. Si distinguono due gruppi di PBP, a basso e ad alto
peso molecolare
(HMW), enzimi bifunzionali comprendenti la classe A e quella B, che differiscono per i domini
-terminali.
Le PBP HMW di classe A promuovono sia la
polimerizzazione
del
glicano
dai precursori disaccaridici (successive addizioni delle unità glicopeptidiche MurNAc(-L-Ala-D-isoGlu-L-Lys-D-Ala-D-Ala)-GlcNAc a C55-PP-MurNAc(-L-Ala-D-isoGlu-L-Lys-D-Ala-D-Ala)-GlcNAc) sia la transpeptidazione (cross-linking) dei peptici della parete. Quest'ultima reazione consiste nella rimozione proteolitica della D-Ala all'estremità C-terminale del pentapeptide e nella formazione di un nuovo legame ammidico tra l'aminogruppo del peptide trasversale (crossbridge) e il gruppo carbonilico della D-Ala in posizione 4. Questa reazione è il bersaglio degli antibiotici beta-lattamici che mimano la struttura della D-alanil-D-alanina. Dopo la reazione proteolitica, gli antibiotici beta-lattamici continuano a occupare il residuo serinico del sito attivo delle PBP, inibendole.
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